Scientific Reports 13권, 기사 번호: 10907(2023) 이 기사 인용
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극저온 이미징은 동물 모델에서 형광 세포 또는 미세구의 생체 분포를 연구하는 데 효과적으로 사용되었습니다. 순차적인 슬라이스별 형광 이미징을 사용하면 형광 세포 또는 미소구체를 감지하여 조직 내 분포를 정량화할 수 있습니다. 그러나 슬라이스가 너무 얇으면 데이터 과부하가 발생하고 스캔 시간이 과도해집니다. 슬라이스가 너무 두꺼우면 셀이 누락될 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 최적의 슬라이스 두께 결정을 돕기 위해 형광 세포 또는 미소구체의 검출을 위한 모델을 개발했습니다. 주요 요소로는 단면 두께(X), 형광 세포 강도(Ifluo), 유효 조직 감쇠 계수(μT) 및 검출 임계값(T)이 있습니다. 이 모델은 스캔 시간을 최소화하면서 거의 이상적인 감도를 제공하는 최적의 슬라이스 두께 값을 제안합니다. 또한 이 모델은 슬라이스 두께가 지나치게 큰 이미지 데이터를 획득한 경우 누락된 셀을 보상하기 위한 보정 방법을 제안합니다. 이 접근 방식을 통해 극저온 이미징 작업자는 더 큰 슬라이스 두께를 사용하여 세포 수를 크게 손실하지 않고 스캔 시간을 단축할 수 있습니다. 우리는 돼지 심장의 형광 마이크로스피어와 마우스 모델의 형광 표지된 줄기 세포라는 두 가지 독립적인 연구의 실제 데이터를 사용하여 모델을 검증했습니다. 결과는 시뮬레이션과 실제 데이터의 슬라이스 두께와 감지 감도 관계가 99% 상관 관계 및 2% RMS(평균 제곱근) 오류와 잘 일치함을 보여줍니다. 또한 형광 강도 변화 및 공간 분포와 같은 모델의 주요 가정이 충족되지 않는 상황에서의 감지 특성에 대해서도 논의했습니다. 마지막으로, 우리는 적절한 설정을 통해 저온 이미징이 매우 높은 복구율(검출/전달 횟수)로 형광 세포 생체 분포의 정확한 정량화를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 극저온 이미징 기술은 많은 생물학적 응용 분야에서 사용되었으므로 최적의 슬라이스 두께 결정 및 데이터 수정 방법은 유용성과 신뢰성을 더욱 향상시키는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다.
극저온 이미징은 단일 세포 감도1,2,3,4,5,6,7,8,9 전체 마우스 또는 쥐의 모든 곳에서 형광 세포의 국소화를 가능하게 하는 3D 현미경 이미징 기술입니다. 이 시스템은 전동식 마이크로톰 저온 유지 장치, 명시야 및 형광 용량을 갖춘 현미경, 로봇 포지셔너 및 제어 소프트웨어로 구성됩니다. 극저온 이미징을 수행하기 위해 관심 있는 조직을 액체 질소를 사용하여 급속 냉동하고 절편 단계에 고정하고 교대로 절편 및 이미징을 사용합니다. 이 시스템은 조직의 타일형 넓은 시야, 고해상도(~10μm), 컬러 명시야 및 형광 이미지를 획득합니다. 이미지 조각을 쌓아 생체분포 시각화 및 분석을 위해 3D 이미지 볼륨을 생성할 수 있습니다. 이러한 탁월한 기능은 자기공명영상(MRI) 또는 생물발광 영상(BLI)과 같은 다른 3D 생체 내 영상 방식과 비교할 때 극저온 영상을 독특하게 만듭니다. 이러한 생체 내 이미징 방식은 동물 전체를 이미지화할 수 있지만 적절한 해상도가 부족하고 회색조 이미지만 생성할 수 있습니다. 앞서 언급한 기능을 통해 저온 이미징은 다른 생물학적 연구 이미징 방식의 중요한 격차를 해결합니다.
극저온 이미징은 작은 설치류2,3,4,6,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19를 포함한 다양한 동물 모델에서 형광 세포 또는 미소구의 생체 분포를 연구하는 데 사용되었습니다. ,20, 개7,21, 돼지5,22,23 및 기타 동물 모델24. Burden-Gulley 등13,14,15은 저온 영상을 사용하여 마우스 모델에서 교모세포종 세포의 이동 및 침습적 행동을 시각화했습니다. 최근 우리는 전체 마우스 신체4,17,18,19에 걸쳐 형광 전이를 정량화하고 평가하기 위한 저온 이미징 기반 플랫폼을 개발했습니다. 이 플랫폼은 전이성 암을 감지하고 이해하며 치료하는 데 필수적인 기술 파이프라인(영상화제, 영상화 방법, 치료제, 종양 모델 등)의 평가 및 최적화에 적합한 것으로 확인되었습니다. 우리 자신을 포함한 많은 그룹7,8,24,25은 형광 미세구 포착 방법을 통해 정량적, 고해상도 3D 심근 관류를 공간적으로 해결하는 기술을 사용했습니다. Van Horssen at el. 또한 형광 마이크로스피어7,21,22,23,27 및 형광 표지된 단핵구6의 생체 분포를 시각화하는 기술을 사용하여 동물 심장의 관상동맥 혈관신생 진행 특성을 조사했습니다. 또한, 우리는 이전에 이식편대숙주병(GVHD) 마우스 모델에서 정맥 주사된 줄기 세포와 질병 유발 면역 세포의 전신 생체 분포를 연구하기 위해 저온 이미징 기술을 사용했습니다2,3,9,10,11,12 ,20,28,29. 마이크로스피어 신호와 줄기 세포 신호를 보여주는 형광 이미지의 예는 보충 문서에 나와 있습니다. 생체의학 이미징 연구에서 극저온 이미징의 높은 유용성을 고려하면 이 기술을 활용하는 응용 분야가 점점 더 많아지고 있습니다.
100 µm) is often chosen. The benefits of a larger section thickness include faster imaging and computing times, less memory usage, and longer life for the sectioning knife. However, signals of dimly fluorescent cells embedded in a thick tissue may not reach the surface and may not be detected by the imaging system. The physics of signal loss can be described by the principles of light absorption and scattering in the biological tissue30,31,32,33. In general, by setting a slice thickness that is too large, a significant rate of false negatives can be expected. This would render the results unreliable, particularly in applications that demand accurate absolute quantification. On the other hand, if one sets the slice thickness to be too small, although accurate quantification can be obtained, it would not be computationally or economically efficient. For example, a tissue which can be imaged overnight (12 h) at 120 µm slice thickness will take 3 days (72 h) to scan at 20 µm. There is expected to be an optimal value for slice thickness that will give accurate cell/microsphere counting at a reasonable scan time./p> 20 µm, the number of detected cells will be less than the true number of cells in the tissue as shown in Fig. 3. This situation leads to false negatives. Next, we will propose a mathematical model of the relationship between the fluorescent cell detectability and the slice thickness especially in the sub-optimal range (X > Xoptimal)./p> Xoptimal), the number of detected cells decreases as the slice thickness increases. By formulating the mathematical relationship, one can predict the cell loss and even estimate a correction factor to compensate for the under-sampling. In this section, we aim to construct the relationship under some simplifications./p> Xoptimal (which implies e/X < 1.0), the number of observed cells (n) is reduced from the total cells in the sample (N) according to the relative distribution, d(x), of cells lying in a given slice. The distribution of cells is therefore also related to the probability of a cell being at a given distance, p(x). This can be formulated as/p> Xoptimal), the detection sensitivity decrease as the slice thickness increases. Also, remind that for all X values that are less than or equal to Xoptimal, the Sens value will be 100%. By combining X values from both ideal range (X ≤ Xoptimal) and sub-optimal range (X > Xoptimal), we obtain:/p> Xoptimal) would adversely affect the sensitivity. Three cell intensities were chosen for this simulation: Ifluo = 30, 50 and 80 (grayscale intensity). The numbers were chosen from the intensity distribution of cells derived from our stem cell imaging database. Parameters T and μT were set to 10 (gray level) and 314 cm−1, respectively. The detection threshold value (T) was empirically estimated based on the signal-to-noise-ratio (SNR) in our image data. The value of μT was estimated from mouse tissues in our database using an exponential fitting method proposed by Steyer et al.34. The programming platform used in this study was Matlab 2022a (MathWorks, USA)./p> Xoptimal), the curve appeared as the reciprocal function derived in Eq. (14). By showing the relationship on a log–log scale, the relationship is shown to be perfectly linear (Fig. 6B), as predicted by the mathematical derivation described in Section “In silico simulations for non-compliant situations”./p> Xoptimal)./p> Xoptimal) (Fig. 10C,D)./p> Xoptimal). After running in silico simulations based on the assumptions, we made the following observations. When X ≤ Xoptimal, the Sens value was constant at 100%, but when X > Xoptimal, it decreased as a non-linear function of X (Fig. 6A). The relationship in the sub-optimal range was shown to be a reciprocal function of X Eq. (14). When plotted on a log–log scale, the relationship was linear with a slope of -1 (Fig. 6B). We speculate that this relationship would hold true for real data if the fluorescent cells behaved in a manner that was consistent with our key assumptions. Please note that we also developed a probabilistic model to predict the sensitivity profile in cases where the cell distribution is not uniform Eqs. (7)–(10) and with varying intensity Eqs. (16)–(17)./p> Xoptimal). In many applications, it is necessary for cryo-imaging users to choose a larger slice thickness in order to analyze a large piece of tissues such as pig hearts5,22,23,27, dog hearts7,21, or rabbit tissues24. As the sample volume is prohibitively large, a much larger slice thickness should be selected in order to efficiently optimize the imaging time, the memory space, and other costs. However, the larger the slice thickness beyond the Xoptimal value was, the higher the number of false negatives. In order to mitigate this issue, we propose that the relationship derived in Eqs. (14)–(15) can be used to estimate the true number of cells/microspheres. For example, if researchers conducted a microsphere biodistribution study in a large animal and needed to set a large slice thickness, say X = 100 μm while Xoptimal = 58 μm. By doing so, the cell signals acquired in their image data could be obtained with the sensitivity of only 58% (42% lost) as suggested by Eqs. (14)–(15). For correcting this, one may consider multiplying the number of found microspheres by a factor of 1/Sens (1/0.58 in our example) for estimating the true number of fluorescent microspheres in the tissue. This knowledge allows cryo-imaging operators to use larger slice thickness (much larger than Xoptimal) without significant loss of the microspheres. Such corrections could enable reduced scanning time of a large tissue such as a pig heart, going from days or weeks to hours or days. This finding makes that analyses feasible that may not previously be otherwise./p>
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