기관 형성이 시작될 때 전체 마우스 배아의 시공간 전사체 지도

Nature Genetics 55권, 1176~1185페이지(2023)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

적절한 배아 발달을 위해서는 유전자 발현의 시공간적 조정이 필요합니다. 단일 세포 기술의 사용은 마우스 배아 발생 동안 대부분의 세포 상태에 대한 상세한 분자 정의를 포함하여 초기 조절 역학의 향상된 해상도를 제공하기 시작했습니다. 여기서 우리는 Slide-seq를 사용하여 완전한 배아일(E) 8.5 및 E9.0과 부분 E9.5 배아의 공간 전사체 맵을 구축했습니다. 그 유용성을 지원하기 위해 우리는 지역화된 유전자 발현 패턴의 정량적 조사를 가능하게 하는 3차원 '가상 배아'를 재구성하고 탐색하기 위한 도구인 sc3D를 개발했습니다. 발달 중인 신경관의 주요 배아 축을 따라 측정한 결과 이전에 주석이 달리지 않은 독특한 공간 패턴을 가진 여러 유전자가 밝혀졌습니다. 우리는 또한 Tbx6 돌연변이 배아에서 나타나는 '소성' 신경관의 상충되는 전사 정체성을 특징으로 합니다. 종합하면, 우리는 전체 배아 구조와 돌연변이 표현형에 대한 시공간 조사를 위한 실험 및 계산 프레임워크를 제시합니다.

배아 발달에는 수많은 분자, 세포 및 조직 수준 과정의 정확한 타이밍과 위치가 필요합니다1,2,3,4,5. 이러한 이벤트는 세포 유형 지정, 이동 및 국소화6,7,8,9를 조율하는 유전자 발현의 시공간적 제어를 통해 지시됩니다. 이 규정이 중단되면 배아의 치사율이나 발달 결함이 발생하는 경우가 많습니다5,10,11. 낭배 형성이 끝나고 기관 형성이 시작되면(배아일(E) 8.5~9.5) 조직은 심장 순환, 뇌 구획화 및 신경관 접힘과 같은 주요 형태학적 변화를 경험하여 적절한 구조와 기능을 보장합니다12,13,14. 신경형성을 통해 신경판의 상피 세포는 형태학적으로 정의된 튜브를 형성하기 위해 접혀지며, 이는 배측(DV) 축을 따라 계층화된 유전자 발현 시그니처를 나타내며, 이는 후속 신경 아형 다양화에 필요합니다15,16,17,18,19,20 ,21. 이 과정에 관여하는 많은 유전자가 확인되었지만 이러한 패턴을 지배하는 정확한 유전자 조절 네트워크는 아직 조사 중입니다. 최근의 단일 세포 연구는 운명 지정의 지형에 대한 더 깊은 이해를 제공하기 시작했으며 이러한 세포 상태 전환의 기본이 되는 몇 가지 분자 메커니즘을 강조했습니다. 해리 기반 접근법의 한 가지 한계는 조직 구조를 보존할 수 없다는 점이며, 이는 기본 컨텍스트 내에서 발현 분석을 불가능하게 합니다. 공간 전사체 기술의 최근 발전은 성인 조직 내 세포 유형의 조직을 탐색하고 배아를 발달시키는 것을 목표로 이러한 격차를 메우기 시작했습니다.

이 연구에서 우리는 10μm 공간 해상도33,39에서 전사체 전체 유전자 발현 데이터를 생성하는 기술인 Slide-seq를 사용하여 초기 마우스 기관 형성 동안 전체 배아의 지도를 구축했습니다. 우리의 데이터를 통해 공간적 유전자 발현 패턴, 세포 상태 분포, '가상' 유전자 발현 분석 및 돌연변이 표현형 해부를 위한 3차원(3D) 전사체 맵의 재구성이 가능해졌습니다. 우리는 신경관 형성 및 패턴화에 중점을 두고 공간에서 지역화된 유전자 발현 및 분화 궤적을 식별하기 위해 데이터를 구체적으로 활용했습니다. 전반적으로 우리는 발달 중인 마우스 배아의 유전자 발현 패턴을 탐색하기 위해 접근 가능하고 즉시 사용 가능한 시각화 도구와 함께 포괄적인 고해상도 공간 아틀라스를 제공합니다.

초기 기관 형성 동안 세포 정체성을 공간적으로 매핑하기 위해 우리는 두 개의 대표적인 E8.5, 하나의 E9.0 및 세 개의 부분 E9.5 배아에 Slide-seq를 사용했습니다 (그림 1a 및 확장 데이터 그림 1a). 두 개의 E8.5 배아에 대해 우리는 각각 약 30μm 간격으로 15개 및 17개의 시상 단면(두께 10μm)을 얻었습니다. E9.0 배아의 경우 20μm 간격의 26개의 시상면 섹션이 있고, 3개의 E9.5 배아의 경우 정중선에서 13개의 슬라이스가 얻어졌습니다(그림 1a 및 보충 표 1). 전체적으로 우리는 1,798개의 전사체와 비드당 1,224개의 유전자의 중앙값을 갖는 533,116개의 고품질 비드를 회수했습니다(확장 데이터 그림 1b-d). 각 비드에 할당된 셀 상태를 확인하기 위해 이전에 생성된 단일 셀 참조에 비드를 계산적으로 매핑했습니다(확장 데이터 그림 1e, f). 이 정보를 사용하여 우리는 각 시퀀스된 비드에서 (1) 공간 좌표, (2) 관련 유전자 발현 프로필 및 (3) 세포 상태 할당을 추출했습니다. 전반적으로 우리는 세포 상태의 좋은 정렬과 Ttn(심장), T(꼬리 싹), Meox1(체절) 및 Sox2(신경관, 뇌)와 같은 마커 유전자의 공간적 제한을 관찰했습니다(확장 데이터 그림 2a). -이자형). 또한 우리는 복제물 사이에서 비슷한 배아 구성과 유전자 발현 패턴을 복구하는 데 높은 재현성을 관찰했습니다 (확장 데이터 그림 2c-f).

5 embryos per experiment, and consistently yielded the same phenotype. The Slide-seq experiment was performed on one representative transversal section for WT and two for KO embryos. b, Spatial grid map showing the organization of neural tube 1, 2 and somitic cells in WT and Tbx6 KO embryos. c, UMAP showing the projection of cells assigned to the indicated clusters on the trunk trajectory (Fig. 3c), with the size of the dots representing the degree of uncertainty of mapping to the respective position. d, Dot plot showing the expression of the indicated genes in the three clusters (dot size is percentage of cells per cluster; color is cluster average normalized expression). e, RNA–FISH of the indicated genes in a transversal section of an E9.5 WT and KO embryos. The dotted lines in the schematic denote the AP position within the trunk from which sections were obtained. A representative section from WT and KO embryos at E9.5 is shown. The expression pattern was verified in two of the KO experiments with n > 3 embryos per experiment. Scale bars, 50 µm. f, Schematic showing the transcriptional identity and patterning characteristic of the ectopic neural tubes that arise in the absence of Tbx6 expression, highlighting their conflicting transcriptional identity./p>

0.2; Two-sided Wilcoxon ran sum test). e. Schematic and spatial expression plot distinguishing dorsal and ventral diencephalon/midbrain regions. Shh marks the ventral domain, whereas Fzd10 (Wnt receptor) marks the dorsal part. Each dot represents a bead. The color scale depicts normalized gene expression. Scale bar, 100 µm. D, dorsal; V, ventral; R, rostral; C, caudal./p>0.05 then ranked by FDR). A selected set of previously known genes associated with dorsoventral patterning (black) are highlighted on the right. Specific structures along the axis are highlighted at the bottom of the heatmap. Genes are row z-score normalized and listed in Supplementary Table 7. b. Heatmap showing column scaled z-score of Pearson correlation coefficients comparing the Slide-seq dorsoventral bins and the identified clusters from a neural tube single-cell reference26. RP, roof plate; dp, dorsal progenitors; pMN, motor neuron progenitors; FP, floor plate. c. Heatmap showing an extended subset of the genes that display gene expression regionalization in one of the eight generated bins along the dorsoventral axis (genes filtered by FDR < 0.01 and logFC>0.05 then ranked by FDR). Specific structures along the axis are highlighted at the bottom of the heatmap. Genes are row z-score normalized and listed in Supplementary Table 7. d. Pie chart displaying differentially expressed genes along the dorsoventral axis divided by cellular and molecular function. Genes are listed in Supplementary Table 7. e. Schematic (top panel) and spatial gene expression plots of the known neural tube patterning genes in array E9.5_2. Each dot denotes a bead. The color scale depicts normalized gene expression. D, dorsal; V, ventral; A, anterior; P, posterior. f. RNA-FISH and Slide-seq quantifications for each profiled gene from Fig. 4e. Genes are bin z-score normalized (magenta: RNA-FISH; orange: Slide-seq). D, dorsal; V, ventral./p>

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